En 1544, l'Anhalt-Dessau est divisé et l'Anhalt-Zerbst est recréé au profit de Jean V. En 1562, ses fils Joachim-Ernest et Bernard VII parviennent à réunifier l'Anhalt.
En 1603, les fils de Joachim-Ernest divisent à nouveau la principauté. Zerbst échoit au cinquième, Rodolphe. Sa lignée, qui a également donné les branches cadettes d'Anhalt-Mühlingen et d'Anhalt-Dornburg, s'éteint en 1793.